SDS POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE)
En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. Jel sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid türevi olan N-N’-metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel üzerinde yürütülür. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini belirler. Akrilamid / bisakrilamid oranı yükseldikçe jellerde ısınma fazlalaşır, kırılganlık artar, daha kolay yıkanır.
PAGE sisteminde uygulama sınırları (proteinler için)
Jel yüzdesi Ayrışma Kapasitesi
%5 60,000 – 212,000
%10 18,000 – 75,000
%15 15,000 – 45,000
Polimerleşme reaksiyonunda akrilamid molekülleri yanyana bağlanarak düz zincirler oluştururlar. Bisakrilamid molekülleri ise iki akrilamid zinciri arasında çapraz bağlanmalar oluşturur. Böylece ağımsı bir yapı meydana gelir.
Polimerleşme derecesi;
miktarına göre farklılık gösterir.
Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep olan amonyum per sulfat (APS) reaksiyon başlatıcı, TEMED ise katalizör olarak rol oynar.
SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda (-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.
SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü , molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.
Jelin Hazırlanışı
Poliakrilamid jeli ya iki cam tabakası arasında (slab) ya da ince uzun tüpler içerisinde hazırlanır. Günümüzde en yaygın kullanımı slab jeldir. Slab jelin avantajları, az madde harcanması, pratik oluşu ve örneklerin yan yana karşılaştırılmaları açısından daha kullanışlı olmasıdır.
Cam tabakaların iki yanına jelin arzu edilen kalınlığı ölçüsünde, genellikle teflondan yapılmış birer “spacer” yerleştirilir. Jel ne kadar ince ise resolüsyon o kadar iyi olur (0.5 – 1 mm). Camlar kıskaç yardımıyla sıkıca tutturulur. Jelin alt kısmının geleceği yere yine aynı kalınlıkta teflondan yapılmış dip “spacer”ı yerleştirilir ve kıskaç yardımıyla sıkıştırılır. “Spacer” ve cam tabakalar arasındaki jelin sızıntı yapmasına sebep olabilecek olası boşlukları izole etmek için, tabakanın kenarlarına bir pastör pipeti yardımıyla agaroz çözeltisi dökülür ve kuruması beklenir (yeni sistemlerde bunu yapmadan doğrudan distile su ile kontrol yapılabilir). Herhangi bir sızıntının olup olmadığı su ile kontrol edilir. Sızıntı olmadığından tamamen emin olunduktan sonra jel karışımı ileride belirtildiği gibi hazırlanarak, genellikle bir enjektör yardımıyla hava kabarcığı oluşturmadan boşaltılır.
Jel polimerleşirken su çıkışı olur. Çıkan su yüzeyde birikir ve kurumaya maruz bırakılırsa jel yüzeyinin bozulmasına neden olur. Bu nedenle jel polimerleşmek üzere doldurulduktan sonra üzerine pastör pipeti yardımıyla ve yavaşca bir miktar distile su (n-butanol veya isopropanol) konmalıdır. Böylece hem yüzeyin kuruması önlenir hem de jel yüzeyinin daha düzgün olması sağlanır. Polimerleşme başladıktan sonra ilk 15 dakika içinde %75’e erişir. Polimerleşme gerçekleştikten sonra jelin üst kısmındaki su (n-butanol veya isopropanol) alınarak yerine jeldeki derişimine eş değerde tampon konur ve polimerleşmenin tamamlanması için bir saat bekletilir. Eğer jel karışımı içinde (özellikle % 10 ve üzerindeki yoğunluklardaki jellerde) fazla miktarda çözünmüş hava varsa, polimerleşme sırasında bu hava, kabarcıklar halinde jel içinde kalır ve jel yapısını bozar. Bu nedenle jele TEMED eklenmeden önce vakumlanarak havası alınmalıdır. Sıkıştırma jeli kullanılıyorsa, sıkıştırma jelinin polimerleşmesi tamamlandıktan sonra örnekler hemen uygulanır. Uzun süre beklenirse iki jel arasındaki derişim ve pH farkı ortadan kalkacağından sıkıştırma jelinin fonksiyonu tam olarak gerçekleşmez.
Resolving Gel
%7 %10 %12 %15
H2O 15,3 ml 12,3 ml 10,2 ml 7,2 ml
1,5 M Tris-HCL pH 8,8 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml
20% (w/v) SDS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml
Acrylamide/Bis-acrylamide 6,9 ml 9,9 ml 12,0ml 15,0 ml
(30%/0.8% w/v)
10% (w/v) ammonium persulfate 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml
(APS)
TEMED 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml
Stacking Gel Solution (4% Acrylamide):
| H 2 O | 3.075 ml |
| 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 | 1.25 ml |
| 20% (w/v) SDS | 0.025 ml |
|
Acrylamide/Bis-acrylamide
(30%/0.8% w/v) |
0.67 ml |
| 10% (w/v) ammonium persulfate (APS) | 0.025 ml |
| TEMED | 0.005 ml |